РАЗРАБОТКА ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫХ МОНОНУКЛЕОСОМ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ ТРАНСКРИПЦИИ МЕТОДОМ МИКРОСКОПИИ ОДИНОЧНЫХ КОМПЛЕКСОВ

Флуоресцентная микроскопия одиночных молекул и комплексов становится все более востребованным методом изучения нуклеосом и функционально важных процессов с их участием. В данной работе на основе флуоресцентно-меченой матрицы ДНК разработаны строго позиционированные мононуклеосомы, которые являются новым инструментом для исследования структурных перестроек в хроматине в процессе транскрипции РНК-полимеразой (РНКП). В нетранскрибируемую цепь ДНК были введены два флуорофора — Cy3 (донор) и Cy5 (акцептор), которые после укладки ДНК на гистоновом октамере оказываются в средней части нуклеосомы на соседних участках ДНК на расстоянии менее 60 Е и взаимодействуют по механизму Фёрстеровского резонансного переноса энергии (Fцrster resonance energy transfer, FRET). Изменение структуры нуклеосомы регистрировали по изменению эффективности FRET при изучении одиночных комплексов нуклеосом с РНКП методом флуоресцентной микроскопии. Показано, что введение меток не повлияло на способность РНКП транскрибировать нуклеосомы. Получены и охарактеризованы открытый комплекс с РНКП, а также элонгационные комплексы, остановленные в положениях –39 и –5 до границы нуклеосомы. Показано, что после завершения транскрипции более 80% нуклеосом сохраняют свою структуру, восстанавливая исходную укладку ДНК на гистоновом октамере. Разработанная экспериментальная система открывает новые возможности изучения структуры нуклеосом и модулирующего воздействия на них различных белковых шаперонов и ремоделирующих хроматин комплексов.

• Никитин Д.В.
• Герасимова Н.С.
• Студитский В.М.
• Валиева М.Е.
• Кудряшова К.С.
• Феофанов А.В.
• Чертков О.В.

• Прикладные науки. Медицина. Технология

• Естественные науки
• Сельское хозяйство. Лесоводство