РУАЭСТ (RUAEST)
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА ZONA-FREE ПРИ КЛОНИРОВАНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ (обзор)
В современной биотехнологии широко дискутируется тема создания клонов млекопитающих. В представленном обзоре на основании данных литературы и результатов собственных исследований рассмотрены успехи и проблемы трансплантации ядер соматических клеток (somatic cell nuclear transfer, SCNT), используемой для этих целей, проведен сравнительный анализ традиционной процедуры SCNT и метода zona-free nuclear transfer (zona-free NT). Основные области применения SCNT — терапевтическое и репродуктивное клонирование, получение трансгенных животных, сохранение редких и исчезающих видов, фундаментальные исследования. Так, клонирование элитных быков-производителей позволяло бы воссоздавать их уникальный генетический материал, что невозможно при естественном воспроизводстве. Однако пока что клонирование животных не получило широкого распространения. Одна из причин — низкий выход здорового молодняка, который у крупного рогатого скота, например, составляет в среднем около 9 % от числа трансплантированных клонированных эмбрионов. Считается, что отклонения в развитии плода обусловлены нарушениями, имевшимися в процессе репрограммирования ядра соматической клетки. Хотя в настоящее время предложено несколько практических подходов, позволяющих повысить эффективность метода SCNT, проблема репрограммирования ядра как фундаментальный вопрос биологии развития требует дальнейшего глубокого изучения. Кроме того, проблемой, сдерживающей практическое применение метода SCNT, остается сложность исполнения манипуляций, предусмотренных традиционной технологией, которая была предложена около 30 лет назад S.M. Willadsen (1986) и используется до настоящего времени практически в неизмененном виде. Вместе с тем существенный прогресс был достигнут при клонировании млекопитающих по так называемому zona-free NT методу, когда ооциты перед энуклеацией освобождают от блестящей оболочки. Впервые этот прием был успешно применен T.T. Peura с соавт. (1998), донорами ядер бластомеров в их работе служили эмбрионы крупного рогатого скота. Метод оказался эффективен и при использовании соматических клеток для получения клонированных эмбрионов свиньи (P.J. Booth, 2001), овцы (T.T. Peura, 2003), крупного рогатого скота (P.J. Booth с соавт., 2001), лошади (C. Galli с соавт., 2003). Zona-free NT метод был усовершенствован нами при получении клонированных эмбрионов крупного рогатого скота (Г.П. Маленко с соавт., 2006). В доступных источниках мы не встречали сообщений об использовании zona-free NT другими исследователями в России, хотя в мировой литературе признается, что по сравнению с традиционными приемами он более производителен, проще в исполнении и дает воспроизводимые результаты (I. Lagutina с соавт., 2007; B. Oback с соавт., 2007). При подготовке цитопластов энуклеация ооцитов без блестящей оболочки может проводиться без применения ядерных флуоресцентных красителей при эффективности 95-100 % и сохранении 96-97 % объема ооплазмы (M.I. Prokofiev с соавт., 2007). Частота электрослияния цитопластов без блестящей оболочки с соматическими клетками составляет 95-100 % (I. Lagutina с соавт., 2007; G.P. Malenko с соавт., 2007) по сравнению с 60-70 % при традиционном методе (I. Lagutina с соавт., 2007). Выход бластоцист оказывается равен или превышает этот показатель по сравнению с традиционным методом, результаты трасплантации также сопоставимы. Технология zona-free NT благодаря простоте исполнения и высокой результативности основных этапов рассматривается как эффективный протокол при создании клонированных эмбрионов сельскохозяйственных животных с целью получения жизнеспособного молодняка.